叶绿素是植物生长发育的重要生理指标之一，其含量与植物光合速率、营养状况、光合作用等密切相关，叶绿素含量的测定无论是在生理上还是在品种选育及植物抗性方面的研究都是必测指标[1-2]。叶绿素含量的测定实验是各农业类高等院校大农学相关专业必修课程“植物生理学”实验中的重要组成部分，实验内容涵盖叶绿素的提取、分离、理化性质及定量测定，在叶绿素的定量测定实验内容教学过程中，存在的问题较多，叶绿素含量因提取液和提取时间的不同而存在差异。在实验教学中，采用超市购买的菠菜和油菜作为实验材料，须提前以80%丙酮进行浸泡8～12 h才可将叶绿素完全提取出来。在这个过程中存在一些问题，如学生不能亲自动手进行叶绿素提取操作，丙酮不易购买，实验准备量大等。在叶绿素提取过程中则存在浸提不彻底、浸提时间长且不稳定和叶绿素含量定量测定重复性差等问题。针对以上叶绿素实验教学中存在的问题，本文就实验课中常用实验材料菠菜和油菜从提取方法、提取时间以及浸泡提取剂3个方面进行了研究，找到了在有限的教学学时操作便捷、重复性高、提取效果好的方法，为叶绿素的提取、开发利用和植物生理叶绿素实验教学提供了理论支持[3]。

1 材料与提取方法

1.1 材料、试剂与主要仪器

供试材料为油菜和菠菜，均购自超市，保证材料的新鲜度一致。分析纯试剂为丙酮、乙醇、甲醇和二甲基亚砜。主要仪器包括可见分光光度计(上海棱光S22PC)、单孔八列水浴锅和万分之一电子天平(梅德勒)。

1.2 提取方法

1.2.1 浸提法

采用提取液浸提，选取位置一致的叶片，用潮湿的纱布擦净叶片，避开主叶脉剪成2 mm的细条，分别称取细条0.2 g放入提取液中加塞遮光，称量材料确保天平小数点后两位一致，浸提时间为8 h、16 h和24 h，摇匀，将提取液分别于波长645 nm和663 nm下测定吸光度，重复3次。提取液共6种，其中，单一成分的提取液是95%乙醇和80%丙酮，混合提取液是丙酮乙醇(1∶1)、丙酮乙醇水(4.5∶4.5∶1)、丙酮甲醇(1∶1)和丙酮甲醇水(4.5∶4.5∶1)。以上溶液分别提取摇匀后，将溶液分别于波长645 nm和663 nm下测定吸光度，重复3次。从叶绿素溶液的吸收光谱可以看出6种吸收光谱基本相似，在波长433 nm和664～665 nm处都有明显的吸收峰，在波长570 nm处有一间断跳跃，其他不明显的峰谷所对应的波长也基本相同，如550 nm(谷)、583.4 nm(峰)、604 nm(谷)。故提取液浸提法可以套用Arnon法的计算公式[4]，计算叶绿素含量。

叶绿素a含量为：

Chla=()V/1000/W

叶绿素b含量为：

Chlb=()V/1000/W

叶绿素总含量为：

Chla+Chlb=(8.04A663+)V/1000/W

二甲基亚砜浸提法(DMSO法)是基于Alanetal[5]的方法，用二甲基亚砜(分析纯)在60℃恒温水浴条件下避光浸提实验材料1 h，收集上清液待测。二甲基亚砜法测定吸光度(A)值检测波长为665 nm、649 nm和480 nm，采用以下公式计算。

叶绿素a含量为：

chla=()V/1000/W

叶绿素b含量为：

chlb=()V/1000/W

总叶绿素含量=Chla+Chlb

1.2.2 研磨法

称量材料选取位置一致的叶片且确保天平小数点后两位一致，用潮湿的纱布擦净叶片，并剪成2 mm的细条备用，分别称取0.2 g放入研钵中，分别用95%乙醇和80%丙酮进行研磨提取，过滤洗涤定容至5 mL，摇匀，避光待测。测定计算方法同上。

1.3 数据分析

数据采用Excel进行处理，SPSS进行方差分析。为方便描述，如表1所示。

表1编号和提取液及提取时间对应关系编号提取液及提取时间编号提取液及提取时间195%乙醇浸提8 h12丙酮乙醇浸提8 h295%乙醇浸提16 h13丙酮乙醇浸提16 h395%乙醇浸提24 h14丙酮乙醇浸提24 h495%乙醇研磨提取15丙酮甲醇浸提8 h580%丙酮浸提8 h16丙酮甲醇浸提16 h680%丙酮浸提16 h17丙酮甲醇浸提24 h780%丙酮浸提24 h18丙酮甲醇水浸提8 h880%丙酮研磨浸提19丙酮甲醇水浸提16 h9丙酮乙醇水浸提8 h20丙酮甲醇水浸提24 h10丙酮乙醇水浸提16 h21二甲基亚砜浸提1 h11丙酮乙醇水浸提24 h

2 结果与分析

2.1 叶绿素提取液及提取时间比较

不同提取液和提取时间下菠菜叶绿素含量如表2所示。表2表明，对于菠菜叶绿素含量的测定用95%乙醇提取，提取时间24 h效果最好，和16 h、8 h存在极显著差异(p